Міжнародна програма “Геном людини”
була сформульована на початку 90-х років XX ст. Внаслідок клопіткої роботи до початку 2003 р. геном людини повністю секвенований, тобто повністю прочитана послідовність трьох мільярдів пар основ, з яких побудована ДНК всіх 23 пар хромосом людини. Генетична довжина геному людини складає 3000 сМ (сантиморганіда, генетична відстань, яка дорівнює 1 % кросинговеру). Розв’язання програми “Геном людини” сприяло створенню генетичної карти, відтворенню цитогенетичної карти геному і власне секвенсу
Генетична карта передбачає встановлення послідовності розміщення генетичних маркерів з відстанню не більше1 смвздовж усіх хромосом. Така генетична карта дозволяє картувати будь-який ген, встановити відносну відстань між локусами. Винятковим успіхом програми “Геном людини” було створення інтегральних (фізичних) карт геному.
Картовано близько 40000 кодуючих послідовностей. Загальне число генів, очевидно, складатиме 30500-40000. На сьогодні весь геном людини клонований у вигляді великих фрагментів, які перекривають один одного. Розташування кожного з цих фрагментів на хромосомі визначено з високою точністю. Термін клонування означає, що ген картований, виділений, вивчена його структура, знайдена мутація, яка викликає те чи інше захворювання. Розкриття геному людини сприятиме розвитку нових напрямків медицини, вивченню природи спадкових і злоякісних хвороб, розробці генної і клітинної терапії.
Ґрунтуючись на знанні теорії лінійного розташування генів у хромосомі та на підставі кросинговеру, визначивши відстань між ними, вдалося встановити послідовність генів у хромосомі. А. Стертевант склав першу карту розподілу генів в одній з хромосом дрозофіли. Потім були складені такі карти і для інших хромосом.
Генетична карта – це відрізок прямої, на якій позначено порядок розташування генів і вказано відстань між ними у відсотках кросинговеру. Вона будується на основі результатів аналізуючого схрещування.
Картування проводиться, щоб дізнатися, в якій парі хромосом і на якій генетичній відстані (коефіцієнт рекомбінації), або в якій частині хромосоми розташовані гени.
Побудовано генетичні карти для багатьох об’єктів. Серед покритонасінних рослин краще за все вивчено генетичні карти кукурудзи, ячменю, рису, томатів та ін. У тварин такі карти складено для дрозофіли, а серед ссавців – для миші. Доведено, що такий розподіл генів у хромосомах є загальнобіологічною закономірністю.
У людини аналіз зчеплення генів класичними методами, розробленими на дрозофілі, неможливий внаслідок неможливості експериментальних шлюбів. В останні роки розроблено комплекс методів картування генів на хромосомах людини. Так, для вивчення груп зчеплення і складання карт хромосомвикористовують понад 15 методів.
Картування хромосом у людини проводиться шляхом аналізу родоводів та генетичного аналізу гібридних соматичних клітин.
Тривалий час були відомі тільки три аутосомні групи зчеплення і Х-хромосомна. Новий період розпочався з 1968 р., коли вдалося встановити локалізацію гена групи крові Даффі у хромосомі 1. У людини відомі всі 24 групи зчеплення. З загальної кількості генів геному людини 16000 тепер картовані на скелетній карті геномад, складеній за допомогою 1000 високополімерних ДНК-маркерів. Виявлення груп зчеплення у хромосомах дає можливість побудови хромосомних карт, коли на хромосомі розміщення генів позначають у вигляді цяточок. Найбільш повно побудована карта Х-хромосоми. Локуси, зчеплені з Х-хромосомою (а їх понад 200), віднесені до цієї хромосоми спираючись на аналіз родоводів (багато з них підтверджені методами гібридизації соматичних клітин).
Методи побудови карт хромосом ґрунтуються на передбаченні ймовірності кросинговеру по всій довжині хромосоми і випадкових обмінах між різними хроматидами.
Для картування хромосом застосовують гібридизацію соматичних клітин людини з клітинами різних тварин, переважно з клітинами миші. При культивуванні таких гібридних клітин на живильному середовищі відбувається постійна втрата хромосом людини. Коли в гібридній клітині залишається тільки одна хромосома від каріотипу людини, її можна ідентифікувати шляхом диференціального забарвлення. Визначивши потім вміст певного ферменту в даній клітині, можна стверджувати, що локус гена до цього ферменту розташований в цій хромосомі.
Незважаючи на певні труднощі при побудові генетичних карт і на їх відносність, детальна розробка карт – один з провідних методів аналізу поведінки і тонкої будови хромосом. Складання точних карт хромосом є необхідною передумовою подальшого прогресу теоретичної генетики людини. Це має виняткове значення для виявлення та диференціальної діагностики спадковиххвороб плода, для ранньої діагностики цих хвороб, встановлення носіїв генетичних зрушень, які перебувають у безсимптомній фазі, для визначення медико-генетичного прогнозу. Експресія гена залежить від безпосереднього оточення, в якому він знаходиться. Це так званий ефект положення гена. Зміна активності гена нерідко пов’язана з переміщенням його в іншу групу зчеплення при транслокаціях або зі зміною його положення у хромосомі при інверсіях. Особливий випадок складають зміни експресії генів внаслідок діяльності мобільних генетичних елементів, які активують або пригнічують прояв тих генів, поблизу яких вони вбудовуються.
Сформований в процесі еволюції геном кожного виду являє собою сукупність генетичних одиниць, які представлені в ньому у чітко визначених дозах. В результаті генотипи особин і генотипи їх клітин збалансовані за дозами генів системи. Інколи збільшення кількості генів призводить до підвищення їх дози (прикладом може бути полімерія), але такий ефект спостерігається не завжди. В організмі існують механізми, які підтримують певне дозове співвідношення генів у генотипі. Наприклад, у процесі еволюції виникає механізм інактивації однієї з Х-хромосом у гомогаметної статі XX. Це врівноважує дозу активно функціонуючих Х-генів відповідно з їх дозою в гетерогаметної статі Х0 або ХY.
Порушення дозової збалансованості генотипу організму призводить до різних відхилень у його розвитку. Прикладом можуть бути порушення розвитку організму при хромосомних перебудовах, коли доза генів змінюється в результаті втрати або переміщення фрагмента хромосоми, а також при зміні кількості хромосом у каріотипі (анеуплоїдія або поліплоїдія).
Таким чином, несприятливі наслідки хромосомних і геномних мутацій зумовлені, в першу чергу, порушенням дозової збалансованості генів у генотипі. Отримано достатню кількість доказів того, що мітохондрії людини мають власну спадковість. Ідентифіковані всі гени мітохондріального геному, які успадковуються лише від матері через цитоплазму яйцеклітини. У ньому нараховується 16 600 нуклеотидних пар. Охарактеризовано унікальні властивості організації мітохондріального геному, що відрізняється від ядерного, мутації якого зумовлюють ряд хвороб людини. Виділено окремий розділ генетики – мітохондріальна генетика. Доведено, що мітохондріальна ДНК передається тільки від матері всім її нащадкам і від дочок всім її поколінням (материнське успадкування). Оскільки мітохондріальна ДНК належить тільки одному з батьків, то рекомбінаційні зміни, властиві для ядерної ДНК в мейозі, відсутні, отже відсутня і комбінативна мінливість. Нуклеотидна послідовність зазнає змін від покоління до покоління тільки за рахунок мутацій, які відбуваються в десяток разів інтенсивніше, ніж в ядерній ДНК. Наприкінці XX ст. виник новий розділ медицини – мітохондріальна патологія. Класичними патогномонічними проявами мітохондріальних хвороб вважаються міопатії та енцефалопатії, лактат-ацидоз, синдром Кернса – Сейра, міоклонус-епілепсія та ін. Для хвороб такого генезу властивий значний клінічний поліморфізм.
Останнім часом мітохондріальна ДНК використовується в популяційних дослідженнях, вирішенні питання поширення Homo sapiens по планеті та походження людських рас, походження і генетичної структури окремих етносів і популяцій.
Молекулярно-генетичні методи
Це різноманітна група методів, що застосовуються для виявлення варіацій у структурі досліджуваної ділянки ДНК, а також для розшифровування первинної послідовності основ. Ці методи ґрунтуються на “маніпуляціях” з ДНК і РНК.
Основні етапи молекулярно-генетичних методів:
1. Отримання зразків ДНК або РНК – вихідній етап всіх методів. Джерелом геномної ДНК є будь-які клітини, що мають ядро. Частіше використовують периферійну кров (лейкоцити), хоріон, амніотичн; клітини, культури фібробластів. Основне завдання – накопичення необхідної кількості певних фрагментів ДНК. Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) – це метод ампліфікації ДНК за умов in vitro.Відповідне до нуклеотидної послідовності кінців досліджувано: ділянки застосовують два олігонуклеотидних прай- мери (приманки). Довжина праймерів 20-30 нуклео- тидів. Процес ампліфікації полягає у здійсненні повторюваних циклів.
2. Рестрикція ДНК на фрагменти за допомогою рестриктаз. Основна їх властивість – розривати дволанцюгову ДНК у визначених послідовностях нуклеотидів. Рестриктази – ферменти, виділені з бактеріальних клітин, розрізають молекулу ДНК на фрагменти у визначених місцях. Застосування цих ферментів дає можливість одержати досить короткі фрагменти ДНК, в яких легко можна визначити послідовність нуклеотидів. Розробка методу зворотної транскрипції ДНК на молекулах мРНК визначених білків з наступним клонуванням цих ДНК призвела до появи ДНК-зондів. Використання таких зондів для гібридизації з ДНК-клітин пацієнта дає можливість точно локалізувати генну мутацію.
3. Електрофорез фрагментів ДНК. Кожен фрагмент ДНК займає певне місце у вигляді дискретної смуги в конкретному місці геля.
4. Візуалізація та ідентифікація фрагменті! ДНК у гелі.
Розроблено й інші методи виявлення специфічних фрагментів ДНК за допомогою блот-гібридизації за Саузерном.
Для діагностики спадкових та інфекційних захворювань на рівні ДНК використовують різні методи, зокрема ДНК-зонди (маркери). ДНК-зонд – це ділянка ДНК довжиною від 10 до 6000 пар нуклеотидів, у якій послідовність основ комплементарна послідовності досліджуваної ділянки ДНК (гена, що зумовлює захворювання, або гена вірусу, бактерії).
Технологія ДНК-зондів вимагає знання нуклеотидної послідовності гена, що досліджується. Для локалізації гена зонди, що містять радіоактивні або флуоресцентні мітки, вносяться у ДНК-зразки, що містять біологічний матеріал, отриманий від хворого. За наявності в ДНК комплементарної послідовності зонд приєднується до неї і його можна визначити, вимірюючи радіоактивність або флуоресценцію. Розміри фрагментів ДНК, до яких приєднався зонд, визначають за допомогою методики, що отримала назву блотинг, розроблена американським вченим Саузерном. За допомогою ДНК-зондів ідентифіковані деякі гени людини. Вони використовуються також для діагностики інфекційних захворювань внаслідок визначення послідовності ДНК, унікальної для кожної бактерії або віруса, наприклад, віруса гепатиту В – дуже тяжкого і поширеного захворювання людини. Послідовність нуклеотидів ДНК цього вірусу розшифрована. На даний час випускаються готові діагностичні набори, що містять одноланцюгову ДНК, мічену флуоресцентним барвником, комплементарну одному з ланцюгів вірусної ДНК. Таку одноланцюгову ДНК додають до зразка крові хворого з симптомами гепатиту В. Пробу крові нагрівають для поділу ДНК вірусу на окремі ланцюги. ДНК-зонд приєднується до комплементарного ланцюга ДНК вірусу і відновлює подвійний ланцюг ДНК. Флуоресціюючі ДНК можна побачити, знявши на фотоплівку.
Одним із важливих досягнень в області ДНК- технологій є розробка полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).
Використовуючи ПЛР, можна синтезувати мільйони копій одного гена або будь-яких специфічній ділянок ДНК у пробірці впродовж короткого часу ПЛР отримала свою назву від ДНК-полімерази,ферменту, що сприяє реплікації ДНК у клітині. Реакція ланцюгова, тому що полімераза буде відтворювати реплікацію кожної копії ДНК, що утворилася, нескінченну кількість разів.
Для проведення ПЛР необхідні праймери – короткі послідовності з 20 нуклеотидів, комплементарні нуклеотидам на обох кінцях ділянки ДНК-мішені Праймери необхідні для початку процесу реплікації що буде продовжений ДНК-полімеразою.
Варто зазначити, що для аналізу кожної ділянки ДНК застосовуються свої специфічні праймери. Це дало можливість значно вдосконалити і прискорити діагностику багатьох інфекційних захворювань, зробити більш доступними генетичні дослідження у медичній практиці.
Матеріал підготувала: доцент кафедри мікробіології та вірусології, к.мед.н. Д. Ротар
